逐个光子地构建图像以增加显微镜提供的信息内容
由于快速、紧凑的探测器阵列的出现，激光扫描显微镜的世界正在迅速发展。这些阵列取代了传统共焦激光扫描显微镜的典型单元件探测器，从而实现了新的独特功能。传统探测器仅提供所收集光的强度值，而像素化探测器还可以记录入射光的空间分布，从而有效地为每个扫描点构建照明区域的小图像。
探测器阵列提供的额外空间信息可实现称为图像扫描显微镜 (ISM) 的超分辨率技术。ISM 通过计算从显微镜生成的原始多维数据集中构建单个图像。最终图像的信噪比 (SNR)、光学切片和空间分辨率比传统共焦显微镜更好。详细地说，ISM 图像的横向分辨率可以超过阿贝极限达两倍。然而，这些优点是通过仅利用空间信息来实现的;现代荧光生物成像可以通过时间分辨采集进一步丰富，从而能够获取编码到荧光动力学中的结构和功能信息(例如荧光寿命)。
最近，热那亚意大利理工学院 (IIT) 的研究人员开发了一种紧凑而有效的 ISM 显微镜，配备单光子雪崩二极管 (SPAD) 阵列探测器，能够在单一架构中提供高分辨率结构和功能成像。该研究 发表在黄金开放获取期刊 《Advanced Photonics》上。
报道的 SPAD 阵列探测器由 25 个独立的二极管组成，排列成方形网格。小尺寸和异步读出能够快速检测撞击的荧光光子。基于数字频域 (DFD) 方法的数据采集方案是一种外差采样技术，能够构建定时分辨率低至 400 ps 的荧光衰减直方图，适合大多数荧光成像应用。该技术足够简单，可以在用于控制显微镜和记录检测到的信号的同一现场可编程门阵列(FPGA)板上计算直方图，从而简化了显微镜架构。
得益于 SPAD 阵列探测器提供的独特空间和时间信息，作者演示了荧光寿命 (FL) 测量与 ISM (FLISM) 的组合。除了传统 ISM 的优点外，FLISM 图像信噪比的改进还可以实现更可靠的荧光寿命估计。
该报告通过将 ISM 和时间分辨测量与受激发射损耗 (STED) 显微镜相结合，并使用寿命调谐分离 (SPLIT) 技术，强调了显微镜的多功能性。结果是在不修改采集方案的情况下获得具有增强的横向分辨率和对比度的图像。此外，时间分辨测量可以使用单个探测器进行多物种成像，从而提高结构特异性。
由于荧光动力学的相量表示，该系统可以通过荧光寿命值来区分不同的染料。即使使用具有相似寿命值和重叠激发光谱的染料，它也可以使用脉冲交错激发技术区分不同的荧光团。事实上，通过交替使用不同颜色的激光激发脉冲，光谱信息被有效地编码到时间维度中。由于所提出的显微镜具有出色的时间分辨率，两种荧光染料的贡献可以随后分开以避免串扰。
IIT 分子显微镜和光谱学实验室首席研究员兼通讯作者 Giuseppe Vicidomini 表示：“这项工作的结果表明，激光扫描显微镜的未来与 SPAD 阵列探测器紧密相连，能够通过额外的技术来丰富显微镜数据集。”无需改变共焦显微镜的光学架构即可获得空间和时间信息。” 这项工作表明，SPAD 阵列探测器与定制的采集系统相结合，使光子分辨 ISM 易于访问和使用。
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